PI3K/Akt/mTOR信号通路是细胞内一条关键的信号传导通路，其不仅在细胞生长、代谢、增殖和存活等多种生理过程方面发挥着重要作用，还与多种疾病（如癌症、代谢性疾病和神经退行性疾病）密切相关。
但是总有小伙伴与小P反馈，在该通路检测中总是遇见无信号、各指标变化趋势不一致、分子量不确定等情况。那我们应该怎么做好PI3K/AKT/mTOR信号通路的研究呢？本篇就和小P一起来解密吧~
什么是PI3K/Akt/mTOR信号通路？PI3K/AKT/mTOR通路是一种常见的信号传导通路，主要有三个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成：PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）、丝氨酸/苏氨酸激酶AKT（蛋白激酶B）和mTOR（哺乳动物雷帕霉素靶蛋白）。
PI3K是关键上游激酶。当受体酪氨酸激酶或GPCR与配体结合并激活PI3K，PI3K催化PIP2（磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸）转化为PIP3（磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸），后者招募并激活AKT。AKT磷酸化并抑制TSC2活性，增加Rheb的GTP结合状态。Rheb促进mTORC1的激活，而mTORC2主要受生长因子直接调控。
AKT和mTOR是重要的效应分子，他们通过磷酸化多种底物蛋白广泛参与细胞的生长、增殖、存活、代谢和迁移等过程。
（1）PI3K
PI3K具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性和磷脂酰肌醇激酶活性，参与调节细胞生长的信号通路。PI3K包括三类，其中研究最广泛的是I类PI3K。I类PI3K是由110 kDa催化亚基和85 kDa调节亚基组成的异源二聚体。已知有PIK3CA（p110α）、PIK3CB （p110 β）、PIK3CD （p110 δ）和PIK3CG (p110 γ) 4个I类催化亚基[1]和p85 α等多个分子大小从50至110 kDa不等的调节亚基。
表达特异性：对于110 kDa催化亚基，PIK3CA和PIK3CB在细胞中普遍表达，PIK3CD表达水平最高的是外周血单核细胞、脾脏和胸腺，在前列腺、心脏、大脑和肝脏等其他组织中没有表达[2]，PIK3CG主要在胰腺、骨骼肌、肝脏和心脏中表达[3]。
分子量：催化亚基110 kDa，调节亚基50至110 kDa不等。
注意事项
1. PI3K四种催化亚基，在不同组织和细胞类型中表达水平不一样，建议实验中针对根据组织类型，选择对应的特异性抗体。
2.PI3K四种催化亚基分子大小计算值分布在125 kDa上下，并且在体内会发生以磷酸化为主的翻译后修饰，同时有泛素化修饰位点。实际WB实验检测中可能观测到110-130 kDa范围的条带。
3.PI3K调节亚基p85 α有5种剪接形式，在脑组织和骨骼肌组织的WB实验检测中可能会同时检测到85 kDa和50 kDa左右的异构体形式。
4.PI3K在体内通常以异源二聚体形式存在，若蛋白变性不充分可能会同时检测到聚合体形式的条带，条带大小比预计的偏大。
（2）AKT
AKT是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括AKT1、AKT2和AKT3。AKT包含3个结构域：PH 结构域、催化结构域、调节结构域。AKT调节许多过程，包括代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成，并且在多种癌症中观察到它们的激活。
表达特异性：AKT1和AKT2广泛表达于多种组织。AKT1的磷酸化形式在乳腺癌的进展阶段，即正常到增生（ADH）、导管原位癌（DCIS）、浸润性导管癌（IDC）和淋巴结转移（LNMM）阶段的表达显著增加[4-6]。AKT3在成人脑、肺和肾中高表达，但在成人心脏、睾丸和肝脏中表达较弱；AKT3在胎儿心脏、肝脏和大脑中高度表达，但在胎儿肾脏中则完全不表达。
分子量：AKT1、AKT2和AKT3都有55 kDa左右的异构体，此外还可能检测到AKT1 48 kDa异构体、AKT2 51 kDa 异构体和AKT3 54 kDa异构体。
注意事项
1. AKT1、AKT2和AKT3三种AKT激酶同源性高、表达组织重合且分子量接近，在针对于其中一种激酶做检测的时候，一定要选择高特异性的抗体。Proteintech提供针对于AKT1的特异性抗体80816-1-RR和AKT3的特异性抗体21641-1-AP。
2. AKT1在体内存在磷酸化形式，导致分子量发生变化：磷酸化前AKT1分子量56 kDa，磷酸化后AKT1分子量60 kDa。为了提高实验结果可信度，建议增加阳性对照：HEK293细胞、阴性对照：PI3K抑制剂（如wortmannin）处理。
3. 磷酸化蛋白检测时推荐使用5%的牛血清蛋白被推荐作为阻断剂，而不是脱脂牛奶。
（3）mTOR
mTOR也被称为FRAP1、FRAP、FRAP2和RAPT1，属于PI3/PI4激酶家族。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可以感应ATP和氨基酸以平衡营养可用性和细胞生长。mTOR是mTORC1和mTORC2的激酶亚基，根据营养和激素信号调节细胞生长和存活。mTORC1在对生长因子或氨基酸的响应中被激活。mTORC2也被生长因子激活，但似乎对营养不敏感。mTORC2似乎在Rho GTPase的上游发挥作用，调节肌动蛋白细胞骨架，可能是通过激活一个或多个Rho型鸟嘌呤核苷酸交换因子。mTORC2促进血清诱导的应力纤维或f -肌动蛋白的形成。
表达特异性：mTOR在许多组织中表达，在睾丸中表达水平最高[7-8]。
分子量：mTOR的计算分子质量为289 kDa，观测到的分子量为250-289 kDa。
注意事项
1. mTOR在体内存在多种翻译后修饰，包括磷酸化修饰和泛素化修饰等，同时还有多个糖基化修饰位点。复杂的修饰形式使得实际WB检测时能在250 kDa左右检测到目的带[9]。
2. 磷酸化是mTOR功能相关的重要翻译后修饰形式，通过不同条件刺激可以改变细胞内磷酸化mTOR数量。例如，Calyculin A和EGF刺激会增加磷酸化mTOR表达，而Rapamycin刺激会降低磷酸化mTOR表达[10-11]。
3. mTOR分子量大，需要使用浓度6%的分离胶或醋酸胶（Tris-Acetate gel）体系检测，同时准备一块12%的胶作为内参对照。大分子量蛋白检测实验技巧，可点击本段文字了解。
总结PI3K/AKT/mTOR通路的研究意义在于其在多种细胞活动中的核心调控作用，特别是在癌症的发生、发展、转移和耐药中扮演关键角色。深入研究该通路有助于阐明癌症的分子机制，为开发靶向治疗药物提供新策略，并有望改善癌症患者的预后。
看到这里，各位小伙伴是不是对PI3K/AKT/mTOR信号通路更加了解了呢~还有什么实验的难点，可以私信文末小助手答疑解惑哦（别忘了还能获取高清信号通路海报）~为了让大家的实验更加得心应手，小P列举了一些PI3K/AKT/mTOR信号通路常用的抗体，希望能够帮助到大家。
参考文献
1. Guillard, Sandrine et al. “Molecular pharmacology of phosphatidylinositol 3-kinase inhibition in human glioma.” Cell cycle (Georgetown, Tex.) vol. 8,3 (2009): 443-53.2. Chantry, D et al. “p110delta, a novel phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit that associates with p85 and is expressed predominantly in leukocytes.” The Journal of biological chemistry vol. 272,31 (1997): 19236-41.3. Stoyanov B, et al. Cloning and characterization of a G protein-activated human phosphoinositide-3 kinase. Science. 1995 Aug 4;269 (5224):690-3.4. Mahajan K, Coppola D, Challa S, Fang B, Chen YA, Zhu W, Lopez AS, Koomen J, Engelman RW, Rivera C, Muraoka-Cook RS, Cheng JQ, Schönbrunn E, Sebti SM, Earp HS, Mahajan NP. Ack1 mediated AKT/PKB tyrosine 176 phosphorylation regulates its activation. PLoS One. 2010 Mar 19;5(3):e9646.5. Cinar B, Fang PK, Lutchman M, Di Vizio D, Adam RM, Pavlova N, Rubin MA, Yelick PC, Freeman MR. The pro-apoptotic kinase Mst1 and its caspase cleavage products are direct inhibitors of Akt1. EMBO J. 2007 Oct 31;26(21):4523-34.6. Coffer PJ, Woodgett JR. Molecular cloning and characterisation of a novel putative protein-serine kinase related to the cAMP-dependent and protein kinase C families. Eur J Biochem. 1991 Oct 15;201(2):475-81.7. Chiu MI, Katz H, Berlin V. RAPT1, a mammalian homolog of yeast Tor, interacts with the FKBP12/rapamycin complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20;91(26):12574-8.8. Loewith R, Jacinto E, Wullschleger S, Lorberg A, Crespo JL, Bonenfant D, Oppliger W, Jenoe P, Hall MN. Two TOR complexes, only one of which is rapamycin sensitive, have distinct roles in cell growth control. Mol Cell. 2002 Sep;10(3):457-68.9. Drenan, Ryan M et al. “FKBP12-rapamycin-associated protein or mammalian target of rapamycin (FRAP/mTOR) localization in the endoplasmic reticulum and the Golgi apparatus.” The Journal of biological chemistry vol. 279,1 (2004): 772-8.10. Yang, Chunguang et al. “Downregulation of cancer stem cell properties via mTOR signaling pathway inhibition by rapamycin in nasopharyngeal carcinoma.” International journal of oncology vol. 47,3 (2015): 909-17.11. Huang, Min et al. “Mammalian target of rapamycin signaling is involved in the vasculogenic mimicry of glioma via hypoxia-inducible factor-1α.” Oncology reports vol. 32,5 (2014): 1973-80.
