刚接触NCOA4的WB实验时，我完全是一头雾水。查资料才知道，它有两个亚型：
α亚型理论分子量70kDa，但实际跑胶常出现在80-95kDa；
β亚型小一些，287个氨基酸，理论31kDa，但条带容易模糊，还可能被其他条带掩盖。
另外，它在不同组织里表达差异特别大。最麻烦的是它容易降解，因为和铁蛋白自噬有关，稍微处理不好就被蛋白酶水解了。这些特性让我一开始的实验频频翻车。
一、刚开始做实验时，我遇到的坑……
（一）信号弱到看不见，加样加到心疼
第一次跑胶，按常规加了20μg细胞总蛋白，结果曝光后膜上干干净净，啥条带都没有。后来加到30μg还是不行，一度怀疑抗体有问题（其实是操作细节没做好）。
（二） 条带“乱跑”，位置完全对不上
目标是α亚型（70kDa），结果跑出来条带在90kDa左右，Marker位置明明对得上，就它“跑偏”，换了新胶还是这样，特别懵。
（三） 背景高，目标条带被淹没
好不容易有信号了，但背景一片黑，目标条带根本分不清，洗膜洗了好几次都没用，浪费了好多膜和抗体。
（四）转膜完膜上啥也没有，蛋白全在胶上
有一次转膜后用丽春红染膜，发现胶上还有大量蛋白，膜上只有淡淡痕迹，等于白转了，浪费了我一天时间。
二、踩过很多坑后，我悟了❗❗❗
（一） 针对“信号弱/无条带”：从样品处理到转膜，每个环节都不能马虎
上样量得按表达量调整：低表达细胞得加到30-40μg总蛋白，高表达组织20μg就够，加太多反而容易过载。
（二）转膜条件分亚型设置：
1. α亚型（70kDa+）：用0.45μm PVDF膜，湿转恒流250mA，4℃转90分钟（全程冰浴，避免高温失活）；
2. β亚型（31kDa）：用0.22μm PVDF膜，恒流300mA，4℃转45分钟（小分子容易穿透，时间不能太长）。
3. 裂解液必须加足抑制剂：之前只用基础裂解液，蛋白容易降解。后来换成RIPA缓冲液（50mM Tris-HCl pH7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS），加1×蛋白酶抑制剂混合物和1×磷酸酶抑制剂，冰上裂解30分钟，离心取上清，信号明显出来了。
（三） 针对“条带飘移”：胶浓度要匹配分子量
条带位置不对，原来是胶浓度不合适。α亚型分子量较大，用8%-10%的梯度胶（孔径大，适合大分子分离）；β亚型小，用15%的胶（孔径小，小分子分离更清楚）。换了梯度胶后，条带位置和预期完全对得上，再也没“跑偏”过。
（四） 针对“背景高”：封闭剂选对很关键
一开始用脱脂牛奶封闭，背景总是很高。后来试了5% BSA（用TBST配置），室温封闭1小时，背景明显干净了。抗体稀释比例也要注意：一抗1:1000，4℃孵育过夜（比室温孵育1小时信号强很多）；二抗1:5000，TBST洗3次，每次10分钟，洗干净背景就低了。
（五）针对“转膜失败”：细节决定成败
转膜前一定要活化PVDF膜：用甲醇浸泡30秒，不然蛋白结合不上。转膜缓冲液提前4℃预冷，转膜时用冰浴降温，避免缓冲液升温过快。转膜时用玻璃棒把气泡擀平，防止局部没转上。转完用丽春红染膜检查，确认蛋白转到膜上再进行下一步，避免后续浪费。
三、最后总结几点，收藏起来直接用❗
做NCOA4 WB这半年，从啥也跑不出来到现在条带稳定，最大的感受是：细节太重要了。总结几个关键要点：
（一）先明确目标亚型：α和β的膜孔径、胶浓度、转膜时间都不一样，别混着用；
（二）温度控制好：裂解、转膜全程4℃，避免蛋白降解或修饰丢失；
（三）封闭用BSA：背景高的时候别执着于牛奶，换BSA试试；
（四）转膜后必验证：丽春红染膜花不了几分钟，能避免后续白忙活。
实验刚开始踩坑很正常，多查文献、多试几次，总能摸出规律。希望我的经历能帮学弟学妹们少走点弯路！
