固相萃取的步骤是什么(固相萃取使用方法)

固相萃取的标准操作步骤详解

固相萃取(Solid-Phase Extraction, SPE)是一种广泛应用于样品前处理的技术，其标准操作流程主要包括四个核心步骤：活化、上样、淋洗和洗脱。以下将详细介绍每个步骤的具体操作方法和注意事项，并针对不同应用领域的特殊要求进行说明。

一、标准操作步骤

1. 活化步骤(Conditioning)

目的：除去小柱内的杂质并创造一定的溶剂环境，使填料达到最佳吸附状态。

操作流程：

• 反相柱(如C18、C8)：先用3-5 mL甲醇润洗，再用3-5 mL水或缓冲溶液冲洗，保持流速1-2 mL/min。
• 正相柱(如硅胶)：用3-5 mL非极性溶剂(如正己烷)活化。
• 离子交换柱：用酸/碱溶液调节pH后活化。

注意事项：

• 活化时避免柱床干涸，否则需重新活化。
• 活化后应立即上样，防止填料暴露在空气中时间过长而失去活性。
• 重力法(自然滴落)比吸力法(真空抽滤)效果更好，虽然耗时较长但能获得更理想的柱头吸附效果

2. 上样步骤(Loading)

目的：将样品中的目标物吸附到填料上。

操作流程：

• 样品需提前过滤(0.45 μm滤膜)或离心去除颗粒物。
• 以较慢流速(0.5-1 mL/min)加载样品，避免过载。
• 可调节pH或添加盐以提高目标物保留率。

注意事项：

• 流速控制至关重要，过快会导致吸附不充分，过慢可能引起堵塞。
• 样品需预先处理，根据目标物性质调节pH值和离子强度，提高吸附效率。
• 对于复杂样品，可能需要进行进一步的预处理，如过滤、调整pH值、去除杂质等

3. 淋洗步骤(Washing)

目的：最大程度除去干扰物，保留目标化合物。

操作流程：

• 使用弱洗脱能力的溶剂(如水、低浓度甲醇/乙腈)。
• 淋洗体积通常为3-5 mL，流速1-2 mL/min。

注意事项：

• 淋洗液的选择需根据目标物和杂质的性质，应对杂质有较好的溶解性和洗脱能力，而对目标物的洗脱作用较弱。
• 避免过度淋洗导致目标物损失。
• 淋洗过程中要确保固相萃取柱始终保持湿润，避免柱床干涸

4. 洗脱步骤(Elution)

目的：用小体积的溶剂将目标物从填料中释放并收集。

操作流程：

• 选择合适的洗脱溶剂(如甲醇、乙腈、丙酮或酸性/碱性溶液)。
• 分2-3次洗脱，每次1-2 mL，流速0.5-1 mL/min。
• 收集洗脱液后浓缩或直接分析。

注意事项：

• 洗脱剂的选择应考虑目标化合物的物理化学性质，如极性、溶解度等。
• 洗脱剂的体积是影响洗脱效果的关键因素，过小的体积可能无法完全洗脱，而过大的体积会稀释洗脱液中的目标化合物浓度。
• 对于酸碱敏感的化合物，洗脱剂的初始pH值非常重要

二、不同应用领域的特殊步骤要求

1. 食品安全检测

• 样品处理：农产品需均质提取，乳制品需去蛋白处理。
• 溶剂选择：农残检测常用乙腈-水体系，兽药残留需考虑pH值影响。
• 净化要求：采用保留目标物模式比保留杂质模式净化效果更好。
• pH控制：对于酸性农药，样品需酸化至pH=2-3

2. 环境监测

• 水样处理：需酸化(pH=2.5)以抑制目标物电离。
• 淋洗优化：用弱溶剂(如10%甲醇)去除基质干扰物。
• 目标物选择：针对多环芳烃(PAHs)、农药残留等污染物

3. 药品与生物样品分析

• pH控制：需严格控制样品pH值在目标物pKa±2范围内。
• 基质效应：复杂生物基质可能竞争吸附位点。
• 样品处理：血样需抗凝，尿样需离心去除沉淀

三、常见问题及解决方案

1. 回收率低：

• 原因：流速过快、pH不当、洗脱不充分。
• 解决：优化流速(1-2 mL/min)，调节pH值，增加洗脱液体积或强度

1. 背景干扰大：

• 原因：样品净化不足或固相柱选择不当。
• 解决：增加预处理步骤(如LLE)，选用选择性更强的SPE柱

1. 目标化合物穿透：

• 原因：萃取机理选择不合适或吸附容量不够。
• 解决：改用吸附力更强的固相萃取柱或减少上样量

通过严格遵循这些操作步骤和注意事项，可以确保固相萃取过程的高效性和结果的可靠性，为后续分析提供高质量的样品前处理结果。

固相萃取（SPE）的步骤是一个标准化的流程，但其具体操作会根据吸附剂类型和分析目标进行调整。以下是详细的步骤解析，适用于最常用的反相SPE模式。

固相萃取（SPE）核心步骤总览

固相萃取的本质是一个色谱分离过程，其标准步骤可以概括为以下四个阶段，每个阶段都有其明确的目的和操作要点：

图表代码

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为结合做准备

目标物被保留

去除干扰物

第四步：洗脱

用强溶剂冲洗

将目标物解吸并收集

得到纯化与富集的样品

第三步：淋洗

用弱溶剂冲洗

洗去弱保留的杂质

目标物仍保留在柱上

第二步：上样

将样品溶液

缓慢加入柱中

目标物被选择性保留

第一步：柱预处理

活化

用强溶剂润湿吸附剂

创造结合环境

平衡

用与上样溶剂相容的弱溶剂

冲洗柱床

固相萃取核心步骤

详细步骤分解

第一步：柱预处理（活化与平衡）

目的：去除吸附剂上的杂质，并创造一个适合分析物与吸附剂结合的环境。

1. 活化（Solvation）：

• 操作：用1-2个柱体积的强溶剂（通常是有机溶剂）缓慢通过SPE柱。
• 原理：溶解并洗去吸附剂上可能存在的杂质，同时润湿吸附剂表面，打开其疏水官能团（如C18链），使其充分暴露，准备与分析物结合。
• 常用溶剂：甲醇或乙腈（对于反相SPE）。

1. 平衡（Equilibration）：

• 操作：用2-3个柱体积的弱溶剂（通常是与样品溶剂相容的水或缓冲液）冲洗SPE柱，去除活化用的有机溶剂。
• 原理：使柱床环境与上样溶剂（通常是水相）相匹配。如果柱子在有机相环境下直接上样（水溶液），分析物无法有效保留，会导致穿透（Breakthrough），回收率急剧下降。
• 常用溶剂：水、缓冲盐溶液（pH需调整以确保分析物为中性分子）或<5%的甲醇水溶液。

⚠️ 关键点：整个柱床绝对不能干涸！ 在活化和平衡后，以及上样前，液面应始终保持在吸附剂床层的顶部。如果柱子干了，需要重新活化，否则会导致回收率不稳定。

第二步：上样（Sample Loading）

目的：使样品溶液缓慢通过SPE柱，让目标分析物被选择性吸附在吸附剂上。

• 操作：将处理好的样品溶液（通常是水相或含低比例有机相）转移至SPE柱中，依靠重力、负压（真空）或正压使其以稳定、缓慢的流速（通常1-5 mL/min）通过柱床。
• 优化点：
• 流速：流速越慢，接触时间越长，吸附越充分。过快会导致分析物来不及保留而穿透。
• pH值：对于可离子化的化合物，调节样品溶液的pH至关重要，需确保目标物以中性分子形态存在，才能被反相吸附剂有效保留。

第三步：淋洗（Washing）

目的：洗去吸附剂上弱保留的干扰杂质，而将强保留的目标分析物留在柱上。

• 操作：用1-2个柱体积的弱洗涤溶剂通过SPE柱，并弃去流出液。
• 原理：使用强度刚好能洗掉杂质，但又不足以洗脱目标物的溶剂。
• 常用溶剂：通常是含5-20%有机相（甲醇/乙腈）的水溶液或缓冲液。有时也会使用纯水来洗掉盐分。
• 优化点：可以尝试不同比例的淋洗液，在保证目标物回收率不损失的前提下，找到能去除最多杂质的最强淋洗条件。

第四步：洗脱（Elution）

目的：用强溶剂将目标分析物从吸附剂上解吸下来，并进行收集。

• 操作：用1-2个柱体积的强洗脱溶剂通过SPE柱，并仔细收集全部流出液。
• 原理：使用强度足够的溶剂，破坏分析物与吸附剂之间的相互作用（疏水作用、离子键等）。
• 常用溶剂：
• 反相SPE：甲醇、乙腈、丙酮或其与水的混合液。对于强保留化合物，可使用二氯甲烷/异丙醇等更强溶剂。
• 离子交换SPE：通过改变pH的溶剂来洗脱（如含2-5%甲酸的甲醇用于洗脱碱性化合物）。
• 技巧：
• 流速：慢速洗脱以确保充分解吸。
• 体积：分两次用小体积洗脱（如2 x 0.5 mL）比一次大体积洗脱（1 x 1 mL）效率更高。
• 干燥：在洗脱前，可增加一个抽干或氮吹干燥步骤，去除残留水分，避免稀释洗脱溶剂，提高富集因子（特别对GC分析重要）。

洗脱后处理（可选但常见）

1. 蒸发与复溶（Reconstitution）：

• 操作：收集的洗脱液通常含有高比例有机溶剂，可能需要使用氮吹仪在温和加热下吹干。
• 目的：去除溶剂，实现富集。
• 复溶：将吹干后的残渣用小体积的、与后续仪器分析（如HPLC流动相）兼容的溶剂重新溶解。
• 好处：大幅提高方法灵敏度。

1. 过滤：

• 操作：将复溶后的样品通过针头式过滤器（如0.22 µm尼龙膜或PTFE膜）。
• 目的：去除可能存在的微小颗粒，保护色谱柱和仪器。

总结与注意事项

步骤目的常用溶剂（反相SPE为例）关键要点1. 活化润湿吸附剂，去杂质甲醇、乙腈2. 平衡创造适合保留的环境水、缓冲液柱床绝不能干！3. 上样目标物被吸附样品水溶液控制流速，调节pH4. 淋洗去除弱保留杂质5-20%甲醇/水弃去流出液5. 洗脱收集目标物纯甲醇/乙腈收集流出液，控制流速（后处理）富集、复溶、过滤兼容分析仪的溶剂提高灵敏度，保护仪器

遵循这些步骤，并针对您的具体分析物和基质进行优化（特别是pH和溶剂强度的调整），就能成功完成固相萃取操作。