提好的DNA🧬，一测A260/A280<1.5。
这DNA🧬还能要吗？
以往，我第一反应就是有蛋白污染，很严重，得扔。
但这份来自NEB的技术文献告诉我们——不一定，它通过一系列的实验测试，发现了超微量分光光度计测核酸浓度和纯度这件事情，要想测得准，是有很多前置条件的。
一些你看起来很糟糕的结果，未必糟糕；反之，一些看起来ok的数值，可能有大毛病。
接下来，带大家一起读一下这份文档。
01 浓度越低，越难测得准
作者用了一系列不同浓度的DNA🧬样品进行浓度测定，范围从1 ng/μl到150 ng/μl。分别采用了超微量分光光度计和Qubit两种工具。
结果发现，当样品浓度低于5 ng/μl时，超微量分光光度计单次测定的数值波动非常大，例如1 ng/μl时，测了3次，最终算下来的相对标准偏差高达66.9%！
但另一边，用Qubit测的浓度，从低浓度样品到高浓度，相对标准偏差就低很多。但问题是这玩意的使用成本高而且很费时间啊。
接下来，作者用这一批样品继续测纯度，下图是A260/A280的读数。
如果你是实验操作者，看到1 ng/μl、2.5 ng/μl 的读数时，估计要两眼一黑了。
当样品浓度特别低时，其A260/A280的数值可以说是毫无意义（下图蓝色部分）。这种表现随着样品浓度升高，才逐渐趋于正常，一直到样品浓度>50 ng/μl时，A260/A280的每一次测定才基本平稳（下图绿色部分）。
所以，这一组测试说明了什么？就是当样品浓度特别低时，它单次测得的浓度结果大概率是不准的，一定要测，那就多测几次。而低浓度样品，根本就没必要测纯度。
02 看蛋白污染，A260/A230比A260/A280更靠谱
这一组测试，作者将已知浓度的BSA作为蛋白污染源加入两组已知浓度的基因组DNA🧬中。
结果发现，100 ng/μl的基因组DNA🧬（左图），即使加入了100 ng/μl的BSA，它的A260/A280居然还是1.78，和纯的基因组DNA🧬测得的数值几乎一样！
相信你我看到这个结果时，都不会往我的样品是有蛋白污染这个方向去想的。
与此同时，A260/A230的读数显示出了足够的敏感性，无论高还是低浓度的基因组样品，只要混入了BSA，A260/A230的读数都会变得非常低（下图左右的黄色部分读数）。
这说明了A260/A230的异常下降可以作为蛋白污染的重要信号和提示。
为了进一步验证这个假设，作者还做了不同浓度DNA🧬样品混入不同浓度蛋白污染的测试。
结果显示，当DNA🧬浓度足够高的时候，A260/A280几乎无法分辨出高浓度到低浓度的蛋白污染。（下图蓝色框），所以，当A260/A280正常时，不一定没有蛋白污染，最好结合A260/A230一起去看。
03 低浓度的RNA污染不容易检测出来
当我们不知道提取的基因组DNA🧬是否含有RNA污染时，可以用A260/A280的读数是否异常升高来判断。
而这一组测试，目的就是为了找出A260/A280对RNA污染的敏感度。
从结果可以看出，只有当RNA污染达到一定程度（样品中20%是RNA）时，A260/A280读数才会>1.9。
所以，你也可以根据这个表的A260/A280的读数来反推样品中RNA污染的程度有多少。
04 不同盐类污染对纯度读数影响不同
这是不少同学关心的事情，例如大家常常会问我的A260/A230特别低，是不是有污染？
这里，作者非常拿了多个不同的污染物来分别和DNA🧬混合，看看哪种污染物对A260/A230的影响特别大。
下图，大家可以慢慢看，我这里稍微总结一下：
- GTC(硫氰酸胍)、EDTA、和Triton X-100(非离子去污剂)，它们在相对低浓度就能显著影响UV图谱和拉低A260/A230。
- GuHCl(盐酸胍)、Tween 20和乙醇的影像能力较低。
这份技术文档还做了不少项目的测试，例如：植物多糖对纯度的影响、用水还是缓冲液洗脱核酸、TE缓冲液如何影响OD的...这里因篇幅受限，不一一展开。
感兴趣的同学可以拿原件慢慢看，扫码后技术文档原件会自动发送给大家。
