文章来源公众号：医药魔方Pro 作者：三巨木
当前靶向蛋白降解（TPD）技术（如PROTAC、分子胶）高度依赖CRBN、VHL等少数几种E3泛素连接酶。然而人类基因组编码超过600种E3连接酶，许多疾病（尤其是特定恶性『肿瘤』）因缺乏这些常用E3的表达，或靶蛋白难以与之形成有效的三元复合物，导致现有降解剂策略失效。
为了突破这一限制，暨南大学李正球研究员团队在Angew上发表了突破性研究，他们创新性地将具有反应活性的炔酰胺（ynamide）共价弹头整合到靶向蛋白的配体分子上，成功开发出一个依赖新型E3连接酶RBBP7的降解剂平台。该研究从BTK降解剂的机制解析出发，系统验证了该策略在降解多类靶点蛋白以及克服临床耐药性方面的广泛适用性，为拓展TPD的应用边界奠定了重要基础。
研究人员首先在伊布替尼（一种已上市的BTK共价抑制剂）溶剂暴露的哌啶环上引入炔酰胺弹头，得到化合物YT-57。为了优化设计，他们还系统合成了包含不同弹头（如烯酰胺、马来酸内酯、氯乙酰胺、丙烯酰胺等）及不同长度连接链的衍生物进行对比。
在Toledo B细胞淋巴瘤细胞模型中，仅1μM浓度的YT-57处理16小时即可显著降解BTK蛋白（Dmax=83.2%），而其他弹头类型的化合物则基本无效。
进一步优化连接链长度后发现，具有6碳链的化合物YT-58降解活性最优，其DC50值低至0.17μM，Dmax为83%。重要的是，YT-58展现出了比其母体抑制剂伊布替尼强约20倍的抗增殖活性。利用数据非依赖采集（DIA）技术的全细胞蛋白质组学分析进一步证实，YT-58能选择性且高效地降解BTK蛋白。
图1. 将BTK抑制剂改造成降解剂（来源：Angew）
研究人员深入探究YT-58的作用机制后发现，其介导的BTK降解严格依赖蛋白酶体途径。预处理蛋白酶体抑制剂硼替佐米或MG-132能完全阻断降解效应。同时，YT-58能剂量依赖性地抑制BTK及其下游关键信号分子磷脂酶Cγ2（PLCγ2）的磷酸化，其效果显著优于伊布替尼，这与观察到的强效抗增殖活性相符。
为了揭示关键的E3连接酶，研究者采用了共免疫沉淀/质谱联用（Co-IP/MS）和基于活性的蛋白质组学（ABPP）两种互补策略。结果一致地将组蛋白伴侣蛋白RBBP7（也称为RbAp46）锁定为与降解过程密切相关的核心E3连接酶。
在细胞中敲低（knockdown）RBBP7可有效逆转YT-58对BTK的降解作用。此外，YT-58处理能显著增强BTK的多聚泛素化水平，而这种增强效应在RBBP7被敲低后明显受损。免疫共沉淀实验还证实，YT-58能促进形成RBBP7-降解剂-BTK三元复合物。
图2. 化合物YT-58的降解机制（来源：Angew）
接下来的关键位点研究发现，YT-58通过其炔酰胺弹头共价修饰RBBP7蛋白第97位的半胱氨酸（C97），这是驱动BTK降解不可或缺的步骤。重组蛋白结合位点分析和基于活细胞的竞争性半胱氨酸定向ABPP均确认了C97是主要修饰位点。
随后的点突变验证显示，将RBBP7的C97突变为丙氨酸（C97A）会显著削弱YT-58诱导的BTK降解，而其他半胱氨酸位点（C116, C166, C277）突变则无此影响。分子对接也显示C97位于蛋白表面，易于与YT-58发生共价结合。
图3. RBBP7的C97位共价修饰对于YT-58介导的BTK降解至关重要（来源：Angew）
此外，研究人员又对炔酰胺弹头的普适性进行了验证。结果发现，其可有效促进针对多种蛋白质（包括CDK4、PDE5、PI3K、AKT、BCR-ABL、BRD4、EGFRL858R、EGFRL858R/T790M/C797）的降解剂开发。此外，研究人员将炔酰胺连接至泛激酶抑制剂XO44，获得化合物YT-134，该分子可在AGS细胞中可同时降解PI3K、Syk、AKT、GSK-3β等多种激酶。
图4. 炔酰胺共价结构能够降解多种蛋白靶标（来源：Angew）
最后，研究人员设计带有炔烃标签的探针（如泛激酶探针YT-134、BRD4探针YT-172等）进行Pull-down/质谱分析，结合RBBP7敲低实验，证实了RBBP7是支撑该炔酰胺降解剂平台降解多种不同靶蛋白的核心E3连接酶。值得注意的是，普适性更强的泛激酶探针YT-134比选择性更强的BRD4探针YT-172捕获到了更多的E3连接酶，提示其降解活性涉及更广泛的E3网络。
图5. RBBP7可用于多种降解剂的E3连接酶（来源：Angew）
总结而言，这项工作填补了TPD领域新型E3连接酶资源的空白，并揭示了一种利用炔酰胺弹头共价招募E3连接酶的全新机制。他们所开发的“炔酰胺-RBBP7”降解剂平台展现出强大的模块化和普适性。此外，该平台中降解剂的分子量通常小于传统PROTAC，有望改善其药物代谢动力学性质。这一创新策略为快速开发针对“难成药”靶点和耐药靶点的下一代降解剂提供了强大工具，具有广阔的临床转化前景。
