纤维素酶并非一种单一的酶，而是一个复杂的酶系，由多种具有不同功能的酶协同组成。这个酶系主要包括三大类：内切葡聚糖酶（EG）、外切葡聚糖酶（CBH）和β-葡萄糖苷酶（BG）。
内切葡聚糖酶在纤维素分子内部随机作用于β-1,4-糖苷键，将长链纤维素切割成较短的寡糖链。外切葡聚糖酶则从纤维素链的非还原端依次水解β-1,4-糖苷键，释放出纤维二糖。而β-葡萄糖苷酶则进一步将纤维二糖水解为葡萄糖。
从结构上看，纤维素酶通常由三个部分组成：催化结构域（CD）、纤维素结合结构域（CBD）和连接肽（Linker）。催化结构域是纤维素酶发挥水解功能的核心，其特定的氨基酸序列和三维结构决定了酶的底物特异性和催化活性。纤维素结合结构域能够与纤维素表面特异性结合，帮助酶分子定位到底物上，增强酶与底物的亲和力。连接肽则起到连接催化结构域和纤维素结合结构域的作用，具有一定的柔韧性，使得两个结构域能够协同发挥作用。
根据来源的不同，纤维素酶可分为微生物源纤维素酶、植物源纤维素酶和动物源纤维素酶。其中，微生物源纤维素酶应用最为广泛，主要来源于细菌和真菌。真菌产生的纤维素酶产量高、活性强，如里氏木霉是目前研究和应用最深入的产纤维素酶真菌。而细菌来源的纤维素酶则具有耐高温、耐酸碱等特性，在特殊环境下的应用具有优势。
纤维素酶对纤维素的水解过程是一个复杂且精细的多步骤反应。首先，纤维素结合结构域通过其独特的设计，紧密地与纤维素表面相结合，这一步骤确保了催化结构域能够紧密接近并作用于底物纤维素。随后，内切葡聚糖酶开始行动，它专门攻击纤维素内部的β-1,4-糖苷键，这一行为有效地瓦解了纤维素的晶体结构，并创造出新的末端，这些新末端成为了外切葡聚糖酶的理想作用点。外切葡聚糖酶则从这些新形成的末端开始，逐步水解纤维素链，最终生成纤维二糖。在整个水解过程的尾声，β-葡萄糖苷酶接过接力棒，将纤维二糖进一步水解为葡萄糖。这一系列步骤中，各种酶类协同工作，相互增强，共同实现了对纤维素的高效、有序的降解。
纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸(DNS)还原，生成棕红色的氨基化合物，在550nm 波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
